Percentagem de pureza: o que prova

O número é uma proporção do que foi detetado

Uma percentagem de pureza por HPLC é área relativa de pico: o pico principal como fração da área total integrada por esse método, nessas condições. A amostra é empurrada através de uma coluna que separa as moléculas consoante a força com que interagem com ela, um detetor UV regista o que sai, e o software desenha os picos e soma-os. Se o pico principal for 99 % dessa soma, o certificado diz 99 %.

O valor é, portanto, uma proporção da amostra detetada, não de tudo o que está presente. Os picos ao lado do principal são normalmente impurezas relacionadas com o péptido, vindas da síntese ou do armazenamento: sequências a que falta um aminoácido, sequências com um a mais, formas oxidadas ou desamidadas e diastereómeros. D'Hondt e colegas (2014) catalogaram-nas como as impurezas mais frequentes nos medicamentos peptídicos, e são elas que uma boa corrida de pureza por HPLC foi concebida para resolver (veja de onde vêm as impurezas).

O que o método não consegue ver, simplesmente não está no denominador. Água, contra-iões como acetato ou trifluoroacetato, solventes residuais e endotoxinas não são picos cromatográficos numa corrida de pureza normal de péptidos aos comprimentos de onda dos péptidos, pelo que podem estar totalmente ausentes de um valor de 99 %.

Porque é que 99 % não é 99 % em massa

Como esses componentes não peptídicos não dão sinal, uma percentagem de pureza não é uma fração de massa. Um péptido pode ter 99 % de pureza por HPLC enquanto uma parte significativa do seu peso é água e contra-ião. Wang e colegas (2022) mostraram a dimensão desse intervalo quando atribuíram um valor de referência a uma oxitocina sintética por balanço de massas: depois de medir a água por titulação de Karl Fischer, os contra-iões por cromatografia iónica e os solventes residuais por cromatografia gasosa, o teor de péptido ficou em 796,5 mg por grama, apesar de o material ter qualidade farmacêutica corrente por cromatografia.

Há um segundo efeito, mais pequeno, dentro do próprio cromatograma. As percentagens de área assumem que todos os componentes absorvem a luz UV de igual forma por unidade de massa. Não absorvem. A ICH Q2(R2), a diretriz harmonizada sobre validação de procedimentos analíticos, trata disto diretamente: quando uma impureza responde de forma diferente do composto principal, calcula-se um fator de resposta relativo e, se ficar fora do intervalo de 0,8 a 1,2, aplica-se um fator de correção. Muitos certificados de rotina reportam normalização de área sem correção, o que é aceitável para um teste de pureza, mas é mais uma razão para o número ser uma proporção de sinal e não de substância.

Uma percentagem sem método não é um resultado

A pureza depende do método. A mesma amostra pode dar valores diferentes em condições diferentes: outra coluna, gradiente, fase móvel, comprimento de onda ou tempo de corrida. Uma impureza que coelui com o pico principal num método pode separar-se noutro; um agregado hidrofóbico pode eluir depois de o gradiente terminar e nunca ser integrado. Um valor de pureza só é comparável quando o método de que veio é indicado ao lado.

É por isso que a ICH Q2(R2) trata um procedimento de pureza como algo que tem de ser validado para o seu fim, com especificidade, precisão e intervalo demonstrados para as condições realmente usadas. A forma útil de um resultado de pureza indica, portanto, o método (veja o que o HPLC e a espectrometria de massa estabelecem), a especificação contra a qual o lote foi testado e o valor medido.

A pureza é uma pergunta entre várias

Por trás de qualquer péptido há perguntas separadas: o que é, quão puro é e se é estéril. A pureza responde a uma. Um valor de pureza elevado nada diz sobre se a caneta contém o composto do rótulo, porque o HPLC compara picos pelo tempo de retenção em vez de confirmar a estrutura, e nada diz sobre a esterilidade, que é o que mais importa num produto apresentado para injeção.

Cada lote que vendemos é testado por um laboratório independente exatamente para essas três coisas: identidade por espectrometria de massa, pureza por HPLC e esterilidade. O certificado de cada lote está publicado no nosso índice de COA como PDF simples, e o código QR da caneta abre o mesmo documento. Tome a caneta MOTS-C 32 como exemplo: o certificado a que chega pelo seu código QR é o relatório do lote exato, não uma amostra genérica.

As monografias farmacopeicas dos medicamentos peptídicos autorizados vão mais longe. Uma especificação completa de libertação acrescenta normalmente um valor de teor ou doseamento contra um padrão de referência calibrado, teor de água, teor de contra-iões, solventes residuais e um limite de endotoxinas, que foi como o estudo de balanço de massas acima foi montado. São testes adicionais dentro de um dossiê regulamentar, e a sua ausência num certificado não torna menos reais os testes que lá estão. Significa, isso sim, que o valor de pureza deve ser lido pelo que é: o resultado cromatográfico desse lote, pelo método indicado.

Ler o certificado a par da encomenda

Um certificado documenta o lote no momento do teste laboratorial. Nada pode dizer sobre o que aconteceu depois, e é por isso que enviamos em embalagem isotérmica com elemento refrigerante e indicador de temperatura, mantendo as canetas a 2–8 °C desde o nosso ponto de expedição na República Checa até ao seu frigorífico, em 3–5 dias úteis com rastreio porta a porta para Portugal continental e, por vezes, mais um ou dois dias de trânsito para os Açores e a Madeira. O indicador responde à pergunta do transporte; o certificado responde à pergunta da libertação. Verifique ambos quando a encomenda chegar: olhe para o indicador (correspondência de lote cobre o lado do certificado). Se mostrar uma quebra, substituímos a caneta gratuitamente após uma fotografia ou um vídeo curto, diga o certificado o que disser, porque o certificado não pode provar retroativamente a estabilidade em condições que nunca mediu.