HPLC vs espectrometria de massa

O que o HPLC estabelece

A cromatografia líquida de alta eficiência empurra uma amostra dissolvida, sob pressão, através de uma coluna empacotada. Cada componente interage de forma diferente com o material da coluna, pelo que o péptido principal, os fragmentos mais curtos e as impurezas ligadas à síntese saem da coluna em momentos diferentes. Um detetor, normalmente de absorvância no ultravioleta, regista cada um como um pico. A área do pico principal dividida pela área de todos os picos detetados é o valor reportado como pureza. O HPLC de fase reversa com deteção UV está entre as técnicas mais usadas para caracterizar péptidos farmacêuticos sintéticos, como Sharma e colegas (2022) expõem na sua revisão sobre desenvolvimento de métodos cromatográficos.

O que o HPLC não diz é qual é a molécula do pico principal. Dois péptidos com hidrofobicidade semelhante podem sair da coluna quase ao mesmo tempo, pelo que um cromatograma com um pico dominante poderia, em princípio, vir de uma sequência mal sintetizada ou de um composto totalmente diferente. O tempo de retenção pode apoiar a identidade quando é comparado com um padrão de referência, mas, por si só, é uma separação, não uma confirmação estrutural.

O HPLC também não mede quanto péptido há na caneta. Um valor de pureza de 98 % descreve a composição do que foi detetado na amostra testada, não os miligramas de péptido ativo em solução. A concentração é uma determinação separada, com método próprio; o nosso artigo sobre o que uma percentagem de pureza prova aprofunda essa distinção.

O que a espectrometria de massa estabelece

A espectrometria de massa ioniza as moléculas de uma amostra e mede a sua razão massa/carga. Para um péptido, a massa observada é comparada com a massa teórica calculada a partir da sequência de aminoácidos declarada. Se as duas coincidirem dentro da tolerância do instrumento, o material tem a massa esperada para o composto do rótulo. É essa comparação que faz dele um teste de identidade: uma sequência que difira num único resíduo tem uma massa diferente, porque cada aminoácido acrescenta um incremento definido ao total.

A espectrometria de massa não é, por natureza, uma medição de pureza ou de quantidade. Uma amostra pode dar um espetro limpo para o péptido-alvo e ainda assim transportar uma parte substancial de material não relacionado que não ioniza bem nas condições usadas. Uma coincidência de massa também não confirma todas as posições da sequência. Os isómeros partilham a massa, pelo que um péptido com dois resíduos trocados, ou com um resíduo na forma estereoquímica errada, lê-se como a molécula correta. Lian e colegas (2021), ao rever a caracterização por LC-MS de péptidos terapêuticos sintéticos, destacam os isómeros estruturais e os epímeros como as impurezas que precisam de separação cromatográfica dedicada antes de o espectrómetro de massa as conseguir distinguir.

Numa caneta combinada como BPC-157 & TB-500 ou CJC-1295 & Ipamorelin, a pergunta da identidade duplica-se: ambos os péptidos têm de mostrar a massa esperada.

HPLC e espectrometria de massa lado a lado

Os dois métodos respondem a perguntas diferentes, e é por isso que aparecem como linhas separadas num certificado e não como uma pontuação de qualidade combinada.

O teste de esterilidade fica fora de ambos. É um teste microbiológico, por cultura ou por um método rápido validado, que procura organismos viáveis na solução e reporta aprovado ou reprovado face aos limites farmacopeicos. Nada diz sobre identidade química ou pureza, e os dois métodos químicos nada dizem sobre contaminação. Um certificado de uma caneta pré-carregada transporta, por isso, três resultados independentes: identidade, pureza e esterilidade.

Porque é que um certificado precisa dos dois

Identidade sem pureza diz-lhe que o composto certo está presente, mas não em que proporção; o mesmo espetro poderia vir de uma amostra que é 95 % o péptido do rótulo ou de uma que é sobretudo outra coisa. Pureza sem identidade diz-lhe que a amostra é em grande parte uma única substância, mas não qual. Cada resultado deixa uma lacuna que só o outro consegue fechar.

Ambas as lacunas são realistas num péptido sintético. A síntese pode correr limpa na sequência errada, ou correr na sequência certa e deixá-la carregada de sequências truncadas e com deleções; Lian e colegas (2021) descrevem impurezas que surgem tanto das matérias-primas como do processo de fabrico e do armazenamento. Dois testes de rotina cobrem os dois casos.

As orientações analíticas tratam os métodos como complementares pela mesma razão. A ICH Q2(R2), a diretriz harmonizada sobre validação de procedimentos analíticos adotada em novembro de 2023 e em vigor na UE desde junho de 2024, inclui a especificidade, a exatidão e a precisão entre as características que um procedimento validado tem de demonstrar, e aceita a comparação com um procedimento ortogonal, que mede uma propriedade diferente da mesma amostra, como forma de as demonstrar. Para um péptido, a separação cromatográfica e a medição de massa são esse par ortogonal.

O que os nossos certificados mostram

Cada lote é testado por um laboratório independente quanto à identidade por espectrometria de massa, à pureza por HPLC e à esterilidade, e o certificado desse lote é publicado como PDF simples no nosso índice de COA. Não é preciso conta para o abrir. Ler o código QR da caneta leva-o ao mesmo certificado, pelo que o lote no rótulo e o lote no documento são o mesmo. O valor de pureza é o resultado medido pelo laboratório para esse lote. A caneta chega a Portugal a partir do nosso ponto de expedição na República Checa, dentro da UE, sem intervenção da Autoridade Tributária e Aduaneira nem formalidades de importação.

O certificado indica também a concentração medida do cartucho, em miligramas por mililitro e péptido total nos 3 ml, que é o valor de teor que a pureza por HPLC, por si só, não lhe pode dar. Existem outros testes na prática farmacopeica para medicamentos autorizados, como o teor de água, os solventes residuais e as endotoxinas; esses não fazem parte do nosso certificado.