Porcentaje de pureza: qué prueba

El número es una proporción de lo detectado

Un porcentaje de pureza por HPLC es área relativa de pico: el pico principal como fracción del área total integrada por ese método en esas condiciones. La muestra pasa por una columna que separa las moléculas según cuánto interactúan con ella, un detector UV registra lo que sale y el software dibuja los picos y los suma. Si el pico principal es el 99 % de esa suma, el certificado dice 99 %.

Así que la cifra es una proporción de la muestra detectada, no de todo lo presente. Los picos junto al principal suelen ser impurezas relacionadas con el péptido, procedentes de la síntesis o del almacenamiento: secuencias a las que falta un aminoácido, secuencias con uno de más, formas oxidadas o desamidadas y diastereómeros. D'Hondt y colaboradores (2014) las catalogaron como las impurezas más frecuentes en los medicamentos peptídicos, y son las que un buen método de pureza por HPLC está diseñado para resolver (ver de dónde vienen las impurezas).

Lo que el método no ve no está en el denominador. El agua, los contraiones como acetato o trifluoroacetato, los disolventes residuales y la endotoxina no son picos cromatográficos en un análisis estándar de pureza de péptidos a las longitudes de onda habituales, así que pueden faltar por completo en una cifra del 99 %.

Por qué 99 % no es 99 % en masa

Como esos componentes no peptídicos no dan señal, un porcentaje de pureza no es una fracción de masa. Un péptido puede tener una pureza del 99 % por HPLC mientras una parte apreciable de su peso es agua y contraión. Wang y colaboradores (2022) mostraron el tamaño de esa brecha al asignar por balance de masas un valor de referencia a una oxitocina sintética: tras medir el agua por valoración Karl Fischer, los contraiones por cromatografía iónica y los disolventes residuales por cromatografía de gases, el contenido en péptido resultó ser de 796,5 mg por gramo, aunque el material era de calidad farmacéutica ordinaria por cromatografía.

Hay un segundo efecto, menor, dentro del propio cromatograma. Los porcentajes de área asumen que todos los componentes absorben luz UV por igual por unidad de masa. No es así. La ICH Q2(R2), la directriz armonizada sobre validación de procedimientos analíticos, lo aborda directamente: cuando una impureza responde de forma distinta al compuesto principal, se calcula un factor de respuesta relativo y, si queda fuera de 0,8–1,2, se aplica un factor de corrección. Muchos certificados rutinarios informan de una normalización de áreas sin corregir, aceptable para un ensayo de pureza, pero una razón más de que el número sea proporción de señal y no de sustancia.

Un porcentaje sin método no es un resultado

La pureza depende del método. La misma muestra puede dar cifras distintas en condiciones distintas: otra columna, otro gradiente, otra fase móvil, otra longitud de onda u otro tiempo de análisis. Una impureza que coeluye con el pico principal en un método puede separarse en otro; un agregado hidrofóbico puede eluir tras el final del gradiente y no integrarse nunca. Una cifra de pureza solo es comparable cuando el método del que procede se indica junto a ella.

Por eso la ICH Q2(R2) trata un procedimiento de pureza como algo que validar para su finalidad, demostrando especificidad, precisión y rango en las condiciones reales de uso. La forma útil de un resultado de pureza indica, por tanto, el método (ver qué establecen HPLC y espectrometría de masas), la especificación frente a la que se analizó el lote y la cifra medida.

La pureza es una pregunta entre varias

Detrás de cualquier péptido hay preguntas separadas: qué es, qué grado de pureza tiene y si es estéril. La pureza responde a una. Una cifra alta de pureza no dice nada sobre si la pluma contiene el compuesto de la etiqueta, porque la HPLC compara picos por tiempo de retención en lugar de confirmar la estructura, ni nada sobre la esterilidad, lo que más importa en un producto presentado para inyección.

Cada lote que vendemos lo analiza un laboratorio independiente precisamente para esas tres cosas: identidad por espectrometría de masas, pureza por HPLC y esterilidad. El certificado de análisis (COA) de cada lote está publicado en nuestro índice de COA como PDF, y el código QR de la pluma abre el mismo documento. Toma la pluma MOTS-C 32 como ejemplo: el certificado al que llegas desde su código QR es el informe de ese lote exacto, no una muestra genérica.

Las monografías de farmacopea para medicamentos peptídicos autorizados van más lejos. Una especificación de liberación completa añade normalmente una cifra de contenido o valoración frente a un patrón de referencia calibrado, contenido en agua, contenido en contraiones, disolventes residuales y un límite de endotoxina, que es como se montó el estudio de balance de masas de arriba. Son ensayos adicionales de un expediente regulatorio, y su ausencia en un certificado no hace menos reales los que sí figuran. Sí implica leer la cifra de pureza por lo que es: el resultado cromatográfico de ese lote con el método indicado.

Leer el certificado junto al paquete

Un certificado documenta el lote en el momento del análisis en el laboratorio. No dice nada de lo que pasó después, y por eso enviamos en embalaje isotérmico con elemento refrigerante e indicador de temperatura, a 2–8 °C desde nuestro punto de envío en Chequia hasta tu nevera en España: 3–5 días laborables con seguimiento, sin aduanas dentro del mercado único, y uno o dos días más de tránsito en Baleares o Canarias. El indicador responde a la pregunta del transporte; el certificado, a la de la liberación. Comprueba ambos cuando llegue el paquete: mira el indicador (coincidencia de lote cubre la parte del certificado). Si muestra una desviación, sustituimos la pluma sin coste tras una foto o un vídeo corto, diga lo que diga el certificado, porque este no puede demostrar retrospectivamente la estabilidad en condiciones que nunca midió.